GOLDEN RICE 

Slika 1: Primerjava divjega (bel) in gensko spremenjenega riža (oranžen).

Vir: Golden rice - five years on the road - five years to go?; Salim Al-Babili, Peter Beyer

1.      VITAMIN A  in VAD

Zlati riž ali »golden rice« (GR) imenujemo gensko spremenjen riž, zlato-rumene barve, ki v zrnu vsebuje b-karotene. Namen raziskav in dela na področju proizvodnje GR je rešiti globalni zdravstveni problem pomanjkanja vitamina A (VAD - vitamin A defficiency), ki je prisoten v več kot 100 državah, za posledicami pa trpi nad 50 milijonov prebivalcev.  

V človeški organizem lahko vitamin A vnesemo le s hrano, ki je lahko živalskega ali rastlinskega izvora. Glede na to ločimo dve različni biosintetski poti, ki vodita do sinteze vitamina A v telesu.

• Hrana živalskega izvora (jajca, ribe, meso,...) je bogata z retinoidi in vsebuje  tudi retinolne estre, ki so prekurzorska oblika retinola oz. vitamina A.

• Nekatere rastline (špinača, korenje..) vsebujejo pro-vitamin A oziroma b-karoten. Gre za barvilo iz skupine karotenoidov, ki je topno v maščobah. Pri cepitvi z encimom beta-karotenska deoksigenaza se razcepi v dve molekuli retinala oz. drugo obliko vitamina A.

S problemom VAD (Slika 2) se srečujejo predvsem v državah v razvoju med revnim slojem prebivalstva, pri katerem v vsakodnevni prehrani močno prevladuje riž (do 80% kalorij / dan). S takšnim načinom prehranjevanja namreč te skupine prebivalstva ne zaužijejo dovolj velike količine vitamina A, kar vodi v resne zdravstvene težave.

Slika 2: Razširjenost VAD - pojav pomanjkanja vitamina A (rdeča > modra > zelena).

Vir: http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Vitamin_A_defficiency.PNG

Vitamin A je pomemben pri pravilnem metabolizmu železa, sintezi rastnega hormona, sintezi glikoproteinov, za pravilno funkcioniranje epitelijskih celic ter že pri sami diferenciaciji embrionalnih celic.

Prvi znaki pomanjkanja se tako kažejo v oslabljenem imunskem odzivu, motnjah v delovanju organizma. Neposredni pokazatelji pa so težave s suho kožo ter nočna slepota, ki ponavadi vodi v 100% slepoto. To se zgodi ob stalnem pomanjkanju vitamina A, ko se zaradi nenehne izsušenosti očesa in nezmožnosti proizvajanja solz, očesna roženica naguba in okuži. Temu sledi infekcija celotnega očesa, posledica pa je popolna in nepovratna slepota.

2.      BIOSINTETSKA POT do b-KAROTENA

Slika 3: pomen molekule GGPP- geranilgeranil-DP za sintezo različnih molekul.

Vir: http://www.goldenrice.org/Content2-How/how1_sci.html

Slika 4: Shema biosintetske poti do b-karotena.

Vir: Golden rice - five years on the road - five years to go?; Salim Al-Babili, Peter Beyer

Zelo poenostavljeno sintezno pot do vitamina A lahko opišemo le z nekaterimi pomembnimi encimi ter vmesnimi produkti:

• Molekula GGPP - geranylgeanyldifosfat (slika 3)

Je naravno prisotna v hranilnem tkivu riževega zrna.

• Encim phytoene sintaza - PSY

Katalizira reakcijo, ki pretvori dve molekuli GGPP v phytoene. Gre za prvi korak do sinteze provitamina-A.

• Phytoene dezaturaza - PDS

Katalizira  nastanek likopena  z uvedbo 4-ih novih dvojnih vezi v strukturo phytoena.

• Likopene b-ciklaza

Katalizira ciklizacijo likopena do nastanka  provitamina A.

• Beta-karotenska deoksigenaza

Cepi provitamin A v 2 x retinal, obliko vitamina A. Je naravno prisoten v človeškem organizmu.

3.      GENSKI INŽENIRING

Zaradi množične uporabe riža v prehrani prizadetega prebivalstva, je raziskovalna rastlina torej postal riž. Glavni cilj raziskovalcev je bil rastlino tako spremeniti, da bo vsebovala b-karoten. To pa so lahko dosegli le z metodami genskega inženirstva.

Genski inženiring temelji na spremembah osnovnega zapisa DNA nekega organizma z vnašanjem tujih ali odstranjevanjem lastnih genov. Na tak način lahko izbrani organizem pridobi neko novo lastnost, ki se kaže v npr. večji in boljši odpornosti, rezistenci na nek izvor bolezni, večji toleranci na vročino, sušo,.. višji hranilni vrednosti,... Ključni namen pa je v enem organizmu združiti čim več pozitivnih lastnosti iz različnih organizmov.

Prvi korak do gensko spremenjenega organizma je poznavanje njegovega lastnega genskega zapisa. Sledi identifikacija gena, ki ga želimo izolirati in vstaviti, poleg tega pa je potrebno poznati še njegovo regulacijo ter ugotoviti možne interakcije z ostalimi geni, ki delujejo in so aktivirani v istem biokemijskem procesu. Po uspešni izolaciji in pomnožitvi želenega gena sledijo njegove modifikacije, za uspešno izražanje v DNA (Slika 5).

Slika 5: Shema strukture gena za transformacijo.

Vir: http://www.pakissan.com/english/advisory/biotechnology/images/transgene.jpg

1. Markerski gen je namenjen lažji identifikaciji organizmov pri katerih se vstavljeni gen izrazi. Vsebuje npr. gen za rezistenco na nek antibiotik.
   • Promotorska regija določa začetek za prepis gena ter kdaj in kje v organizmu se bo gen izrazil.
   • Terminalna sekvenca pa stoji na koncu gena ter določa konec prepisa.

Nato sledi transformacija modificiranega gena. Ena od metod je agrobakerijska, pri kateri gen vstavimo v plazmidno DNA Agrobakterije tumefaciens (Slika 6, 7, 8).

Gre za bakterijo, ki pri rastlinah povzroča okužbo in rast tumorjev. Zapise za to pa nosi na specifičnih genih v plazmidni DNA (Slika 8). Ti geni se kot odsek plazmida (T-regija), prenesejo preko stene celic rastline in vgradijo v rastlinsko DNA. Te gene zato odstranimo. Bakterije nato gojimo v gojišču z izbranimi organizmi (semeni rastline) ter tako omogočimo prenos in vgraditev transformiranega gena.

Slika 8: Struktura plazmidne DNA Agrobakterije tumefaciens.

Vir: http://arabidopsis.info/students/paaras/ti_plasmid.jpg

PROTOTIP GR

Začetki ideje zlatega riža segajo v leto 1990 in so bili možni zaradi naglega razvoja in napredka metod rekombinantne DNA ter zaradi vedno boljšega in popolnejšega poznavanja raznih biokemijskih in biosintetskih poti.

V letu 1999 pa so raziskovalci pričeli s konkretnim laboratorijskim delom. Prve prototipe zlatega riža so ustvarili po mnogo poskusih, s katerimi so ugotovili, da divji tip riža vsebuje prekurzorsko molekulo za sintezo GGPP. Ta prekurzorska molekula bi torej s pomočjo encima PSY (izolirali so ga iz narcis), lahko vodila naprej do sinteze b-karotena. Toda do izražanja obarvanih b-karotenov v tem primeru ni prišlo, iz česar so sklepali, da eden ali več encimov: PSY, PDS, ZDS,.. ni bilo aktivnih. (slika 4, zeleno)

Sledila je izolacija in uporaba bakterijskih genov za encima PSY in CRTI (slika 4, modro).

CRTI je namreč encim, »enakovreden« trem rastlinskim encimom: PDS, ZDS in CRTISO saj nadomesti njihovo odsotnost. CRTISO pretvori phytoen direktno v likopen (slika 9). Rezultat vseh transformacij je bil tokrat pozitiven. Ugotovili pa so še, da encim b-LCY pri sintezi b-karotena ni odločilen, saj so pri inserciji njegovega gena uporabili ko-transformacijsko metodo.

Slika 9: Geni, uporabljeni za prototipe GR.

Vir: Golden rice - five years on the road - five years to go?; Salim Al-Babili, Peter Beyer

Končni rezultati vsebnosti b-karotena v prototipu je bil 1,6 mg b-karotena/g riža, poleg tega je bil pomemben predvsem dokaz, de je metoda izvedljiva. Naslednji cilj je bil povečati vsebnost b-karotena v zrnu, ugotoviti kakšno je izražanje prototipov v različnih vrstah riža ter ugotoviti dejansko biološko vednost in možnost izrabe b-karotena iz zlatega riža.

Slika 10: Shema zrna; obkroženo je hranilno tkivo, kjer je največja vsebnost b-karotena.

Vir: http://www.ciaprochef.com/USARice/images/about_rice/rice_grain_detail.jpg

Sledil je razvoj z dveh strani; z javnega in privatnega sektorja. Šlo je za zelo podobne raziskave toda za uporabo različnih genov pod kontrolo različnih promotorjev in vnosov genov na različna mesta, saj sta se obe strani orientirali na ekspresijo različnih encimov v biosintetski poti b-karotena. Poleg tega so pri delu uporabili tudi različne vrste riža.

Primerjava rezultatov je posledično pokazala različne rezultate.

V javnem sektorju so dosegli maksimum 1,6 mg/g (b-karoten /riž),medtem ko so v privatnem sektorju dosegli 6,0 mg/g (b-karotena /riž). Novo vrsto zlatega riža so poimenovali GR 1 (golden rice1).

GOLDEN RICE  2

Raziskavam in odkritjem je sledilo ogromno kritik, namenjenih predvsem javnemu sektorju, zaradi nizke vsebnosti karotenoidov v GR. Zato so se raziskovalci osredotočili na druge encime in na nove poskuse za povečanje količine provitamina A.

Na podlagi raziskovanj so prišli do več ključnih domnev o encimih za sintezo b-karotena:

• Encim DXS bi lahko bil odločilen pri uravnavanju količine karotenoidov, saj je pomemben pri nastajanju izoprenoidov, ki so sicer osnovni gradniki karotenoidov.
• Količino karotenoidov v rižu bi lahko povečali še z večjim izražanjem encimov PSY in CRTI (slika 4).
• Sledile so transformacije z novim vektorjem pFun3. (slika 11) Vključeval je gen za encim CRTI pod vplivom promotorja, ki določa izražanje genov le v hranilnem tkivu zrna. Poleg tega so nato v vektor vnesli še gen za encim DXS izoliran iz narcis. Vendar rezultati niso pokazali večje koncentracije b-karotena, s čimer so potrdili, da ta dva encima nista ključna pri njegovem izražanju.

Slika 11: Vektor pFun3.

Vir: Golden rice - five years on the road - five years to go?; Salim Al-Babili, Peter Beyer

• Nato so se orientirali še na ekspresijo gena za phytoensko sintazo-PSY. Izvedli so eksperimente, s katerimi so primerjali gene za ta encim iz različnih rastlin (side-by-side comparison) ter ugotovili pomembne razlike v izražanju in v akumulaciji karotenoidov.
• PSY-ji iz rastlin, ki sicer vsebujejo velike količine karotenoidov (korenje, paradižnik, narcise) so bili manj efektivni od PSY-jev iz rastlin pri katerih je izražanje sicer minimalno (koruza).
• Tako so z uporabo gena za PSY (Slika 12), izoliranega iz koruze (Zea mays), dosegi izredne rezultate. Količina  karotenov namreč je presegla 37 mg/g (karoteni / riž), od katerega je bilo do 84% b-karotena. Novo vrsto zlatega riža pa so poimenovali GR 2.

Slika 12: Vektor za GR 2.

Vir: Golden rice - five years on the road - five years to go?; Salim Al-Babili, Peter Beyer

4.      UGOTOVITVE O ZLATEM RIŽU

• Raziskave WHO so pokazale, da lahko že s 72g riža GR 2 pokrijemo do 50% potrebe po vitaminu A, glede na dnevno potrebo RDA/otroka.
• Odkrili pa so še, da se zaradi visoke koncentracije b-karotenov v organizmu posledično sintetizira nižja koncentracija luteina v listih. To pa lahko vpliva na nižjo fotosintetsko zmogljivost rastline.

Slika 13: Divji tip riža, GR1, GR2.

Vir: http://www.bioscience-explained.org/SE3.2/pdf/goldricesve.pdf

5.      PRIHODNOST GR in GENSKEGA INŽENIRSTVA

Sledeče raziskave bodo temeljile na naslednjih nerešenih vprašanjih:

• Preveliko izražanje b-karotena vodi v njegovo kopičenje v lipidno-beljakovinskih kompleksih, lipidni globulih oz. izven membran kromoplastov. Možnosti izkoriščanja takšnih virov b-karotena v telesu pa zaenkrat še niso znane.
• Kako točno potekajo procesi razgradnje karotenov v organizmu.(svetloba, temperatura, oksidanti ..)
• Z metodami genskega inženiringa skušajo raziskovalci izboljšati hranilno vrednost raznih živil še s povečanjem izražanja vitamina E, železa, cinka, proteinov,... tudi v rastlinah, ki sicer tega ne proizvajajo.
• Zaenkrat je zlati riž še vedno v poskusi fazi in ga na samem tržišču še ne najdemo. Prvo polje s semeni GR2 so posadili v Louisiani v ZDA, s sodelovanjem tamkajšnje univerze. Polja, namenjena nadaljnjim raziskovanjem, pa najdemo v JV Aziji, na Filipinih ter v Indiji (slika 14).

Slika 14: Polje zlatega riža v JV Aziji.

Vir: http://www.ibike.org/ibike/korea/east/2004/IMGP0765.JPG

6.      VIRI  IN LITERATURA

• Salim Al-Babili, Peter Beyer (2005): »TRENDS in Plant Science«. Golden rice - five years on the road - five years to go?, No. 12, Vol. 10
• Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman (2004): The cell: a molecuar approach; 3rd ed.
• Rodney Boyer (2005): Temelji Biokemije
• Google; http://www.google.si/
• Wikipedia; http://en.wikipedia.org/wiki/Main_Page

Avtor: Tina Lenče, SabinaBožič, Anja Lukan