Njen ustanovitelj Alfred Nobel, švedski znanstvenik, je željo, da dobiček njegovih patentov podelijo v obliki nagrad, zapisal v svoji oporoki leta 1895. Po nekaterih domnevah zato, ker se je čutil krivega za vse človeške žrtve dinamita. Prvič so nagrade podelili leta 1901 vendar samo na petih področjih. Šesto področje, ekonomijo, je predlagala in podelila Švedska banka leta 1969.

Nobelovega nagrajenca izbirajo zelo strogo in izločujoče. Najprej nekaj tisoč ljudi predstavi svoje nominirance, ki jih nato člani komisije in strokovnjaki s tega področja izbirajo in izločujejo, dokler ne ostane samo zmagovalec. Proces je dolgotrajen in zahteva neko daljšo uspešnost na znanstvenem področju, nagrajencev pa je malo. Zato je ta nagrada tako zelo cenjena in priznana. (Slika 1)

Lani (2006) so podelili Nobelovo nagrado za kemijo za raziskovalno delo na področju transkripcije pri evkariontih.

Slika 1: Medalja Nobelove nagrade

Molekularni mehanizmi transkripcije pri evkariontih

Nobelovo nagrado za kemijo v letu 2006 so podelili Rogerju Kornbergu za temeljne raziskave pri preučevanju molekularnih mehanizmov transkripcije pri evkariontih. Transkripcija je proces v celici, v kateri je genski zapis zapisan v DNA, ki se prične z sintezo mRNA s pomočjo encima RNA-polimeraze. Nato se s pomočjo ribosomov mRNA pretvori v proteine v celici. Transkripcija je ena od najbolj bistvenih procesov življenja, proces pa je kontroliran z zelo prefinjenim in zapletenim regulacijskim sistemom. Trenutna potreba po proteinu v celici določi kdaj bo regulacijski sistem sprožil aktivacijo določnega gena.  Kornberg je na molekularnem področju razumevanja transkripcije in njene regulacije pri evkariontskih celicah naredil velik preskok. Ob kombinaciji napredne biokemijske tehnologije in določanja struktur (rentgenska difrakcija in elektronska mikroskopija) mu je na atomarni ravni uspelo rekonstruirati RNA-polimerazo iz kvasovk in še nekaj ostalih kompleksov z DNA, mRNA, nukleotidi in regulacijskimi proteini.

Uvod

Za začetek zgodovine transkripcije pri evkariontih lahko postavimo odkritje Weiss-a in Gladstona o aktivnosti RNA-polimeraze v jedrih celic podganjih jeter pred približno 50 leti. Ta članek je odprl vrata za množične znanstvene raziskave ključnega pomena za razumevanje procesov kot so celična diferenciacija in razvoj večceličnih organizmov, kakor tudi za celične odgovore na zunanje signale.

Ker je iz podganjih jeter težko izolirati RNA-polimerzo, so se poslužili lažje poti in ta encim izolirali iz bakterijskega ekstakta. Jacob-u Mondu in Lwoffu sta leta 1965 poskrbela za vznemirjeje, ker sta prejela Nobelovo nagrado za Fiziologijo in medicino za raziskave na področju transkripcijske regulacije izražanja genov pri bakterijah.

Dolgo je veljalo prepričanje, da sta mehanizem transkripcije in struktura genov enaka v vseh celicah. Danes vemo, da imajo evkarionti, kakor so kvasovke in človeške celice, kromosomsko DNA obdano s proteini in zloženo v nukleosome in visoko urejene oblike kromatina. Tega pri prokariontih ne vidimo. Poleg tega je transkripcijski mehanizem v evkariontskih celicah mnogo bolj zapleten in ima dodatne stopnje regulacije. Razumevanje mehanizma delovanja in regulacije RNA-polimeraze je bistvenega pomena za razumevanje regulacije transkripcije, najpomembnejše regulativne stopnje za nadzor nad izražanjem gena v celici.

Za razliko od bakterij, kakor so ugotovili Roeder in Rutter (1969) ter Chambon (Kedinger et al., 1970), vsebujejo evkariontske celice 3 različne oblike RNA-polimeraz. Vsi geni, ki določajo aminokislinsko zaporedje v proteinu se pri evkarjontih prepiše to z RNA-polimerazo II, ki je glavni protein regulacije transkripcije. V 70-ih so znanstveniki, ki so nadaljevali delo na evkariontskih RNA-polimerazah dokazali, da je RNA-polimeraza sestavljena iz več podenot.

Za razliko od bakterijske RNA-polimeraze, evkariontski encimi sami ne morejo selektivno prepisati DNA. Bakterijska RNA-polimeraza je sestavljena iz 4 podenot, ki sestavljajo osrednjo polimerazo in iz spremenljive pete podenote imenovane sigma (Burgess et al., 1969).

Podenota sigma je potrebna, da osrednja polimeraza prepozna promotor in začetno mesto transkripcije. Promotor je specifično zaporedje nukleotidov na DNA, ki služijo kot izhodiščno točko sinteze RNA. Presenetljivo je to, da takrat ni bilo identificiranih nobenih faktorjev podobnih sigma. Za odkritje takih faktorjev so morali počakati, da se je razvila tehnika, ki je omogočila vzpostavitev brez celičnega sistema sposobnega promotor-specifične transkripcije na eksogeni DNA s pomočjo RNA-polimerazo II.

Prva specifično začeta transkripcija s pomočjo čiste RNA-polimeraze II v ekstraktu celic človeškega tkiva je bila objavljena leta 1979 (Weil et al.).

Na podlagi biokemijske analize so potrdili obstoj več različnih transkripcijskih faktorjev RNA-polimeraze II (Matsui et al., 1980). Te faktorje so poimenovali splošni transkripcijski faktorji, saj so vključeni v transkripcije praktično vseh genov. S podrobnejšo karakterizacijo splošnih transkripcijskih faktorjev RNA-polimeraze II (FTIIB, D, E, F in H) sej je pričelo ukvarjati veliko znanstvenikov. S pomočjo 5 splošnih transkripcijskih faktorjev, RNA-polimeraza II pri evkariontih prepozna začetek na genu, loči verigi trka v matrični DNA, prekopira eno verigo v RNA s pomočjo ribonukleozid-trifosfatkov kot gradnikov in končno med premikanjem po DNA združi dve ločeni verigi DNA.

Koncept promotorjev izhaja iz raziskav transkripcije pri prokariontih, čeprav je pri evkariontih promotorjev  mnogo več kakor pri prokariontih. Nadaljnje raziskave Schaffnerja in sodelvci, leta1981 ter Chambona in sodelavci, leta 1981 so nam odkrile gensko specifične ojačevalne elemente, to so nukleotidna zaporedja v DNA, ki vežejo aktivatorske proteine, ki nadzirajo transkripcijo specifičnih genov (Johnson in McKnight, 1989)

Korenbergovo odkritje

Roger Kornberg se je začel ukvarjati s transkripcijo, ko je raziskoval strukturo kromatina kot podoktorski študent v Cambridgeu. Rentgenska strukturna analiza je takrat pokazala, da je kromatin sestavljen iz ponavljajočih se enot velikosti okrog 100 Å. Fragmentacija kromatina z nukleazo je dala razpadne produkte, katerih velikost je bila večkratnik neke osnovne enote. Leta 1974 sta Kornberg in Thomas odkrila, da histona H3 in H4 tvorita v raztopini tetramer (H3)2(H4)2. Še istega leta je Kornberg predlagal za osnovno enoto kromatina oktamer histona in 200 baznih parov DNA.

Po njegovem prihodu nazaj na Stanford je bil glavni cilj raziskav razumevanje transkripcijske regulacije pri evkariontih. Da bi izkoristil vse prednosti vrste kvasovk Saccharomyces cerevisiae, se je odločil, da bo naredil transkripcijski sistem. Hitro je postalo očitno, da je rekonstruiran sistem, ki je vseboval prečiščeno RNA-polimerazo II in pet splošnih transkripcijskih faktorjev TFIIB, E, F H in TATA vezavni protein (TBP), omogočal samo osnovno transkripcijo in ni reagiral pri dodatku aktivatorskih proteinov, specifičnih za gene. To opažanje je privedlo do nepričakovanega odkritja in izolacije mediatorja, multiproteinskega kompleksa sestavljenega iz okrog 20 različnih proteinov, ter omogočilo razlago nekaterih prejšnjih raziskav. Vloga mediatorja pri vseh evkariontih je, da prenese pozitivne in negativne signale s transkripcijskih faktorjev, ki so specifično vezani na DNA, na RNA-polimerazo II in na splošne transkripcijske faktorje.

Pri bakterijah transkripcijski represorji in aktivatorji direktno reagirajo z RNA in vplivajo na vezavo RNA na promotor. Pri evkariontih pa kromatin in mediator tvorita nove tipe regulacij med gensko specifičnimi transkripcijskimi faktorji in RNA-polimerazo, kar vodi k večji kompleksnosti regulacije. Kljub poznavanju vseh proteinov, vključenih v evkariontsko transkripcijo še vedno zelo slabo razumemo na molekularni ravni procesa, sodelujoče polipeptide so kvečjemu lahko opisane kot kroglaste strukture postavljene okrog protomera DNA (slika 2).  

Strukture kompleksa TBP z delom TATA-škatla DNA in trojnim kompleksom TFIIB, TBP in DNA so odkrili z rentgensko strukturno analizo pred več kot desetimi leti. To je sicer dalo nekaj informacij o prepoznavanju promotorja, ampak le malo o ostalem delu transkripcijskega procesa. Kornberg je sklepal da je RNA polimeraza mogoče osnova, okoli katere je potem zgrajen celoten proces evkariontske transkripcije. Velikost RNA-polimeraze II kvasovk, 12 podenot - 0,5*10⁶ Daltonov, in nestabilnost prečiščenega kompleksa sta oteževala nadaljnje raziskave struktur. Kornberg se je lotil problema z uporabo elektronske mikroskopije in rentgenske strukturne analize ter rešil problem po 20 letih biokemijskega dela z izolacijo in izražanjem proteinov skupaj z razvijanjem metode tvorbe dvodimenzionalnih proteinskih kristalov na lipidnih površinah. Še en pomemben in potreben pogoj je bila vzpostavitev transkripcijskega sistema.

Slika 2: Risba evkariontskega iniciacijskega kompleksa transkripcijskega sistema.

Prelomnica je bilo leto 2001. Izšla sta dva članka v reviji Science, ki sta opisovala strukturo 10 podenot kvasovkove RNA-polimeraze, matrične DNA ter RNA produkta. V prvi strukturi sta dve največji podenoti postavljeni v sredini na eni od rež za vezanvo nukleinske kisline, z več manjšimi podenotami na zunanji strani. Reža je povezana z alfa- vijačnico iz ene od dveh večjih podenot k aktivnem mestu za tvorbo fosfodiesterske vezi in podaljševanje verige RNA. Druga struktura je prikazovala direktno vezavo nukleinske kisline v režo. Zaradi homolognosti RNA-polimeraze II v glivah kvasovkah z ustreznimi proteini v celicah sesalcev je pričakovati, da bo delo s kvasovkami dalo dober model za vse evkariontske RNA-polimeraze z več podenotami, tudi človeške (slika 3).

V poznejših objavah iz Kornbergovega laboratorija so odkrili več novih struktur RNA-polimeraze, ki opisujejo različne funkcionalne komplekse z DNA, RNA, nukleotidi in proteini. Množica podatkov je omogočila dinamično interpretacijo procesa transkripcije. Prvo strukturo podolgovatega kompleksa so dobili z uporabo DNA dupleksa z dolgim 3'-štrlečim koncem na eni od verig. Transkripcijske molekule polimeraze so bile postavljene na specifičnem mestu matric, kjer se zadržujejo zadrževale enega od štirih ribonukleotidov. Ta struktura je prikazovala molekularne pogoje takoj po tvorbi fosfodiestrske vezi med 3'-koncem verige RNA in vstavljajočim ribonukleotidom pred premestitvijo hibrida DNA-RNA. V novejši strukturi transkripcijskega kompleksa je bil encim povezan s 15-nukleotidno DNA in 9-nukleotidno RNA v prisotnosti  3' koncem deoksiadenozinnukleotida. V tem kompleksu je vezno mesto prihajajočega nukleotida nezasedeno in predstavlja stopnjo po premestitvi hibrida DNA-RNA.

Slika 3:  Struktura transkripcijskega kompleksa RNA-polimeraze II

Premestitev

Premestitev hibridne vijačnice DNA-RNA med transkripcijo verjetno vključuje zgoraj omenjeno s povezovalno. Stranski verigi dveh ostankov v povezovalni vijačnici pod aktivnim centrom, treonina 831 in alanina 832, se dotikata nukleotidne baze na koncu hibridnega področja. Vijačnica je ravna pri kvasovkini RNA-polimerazi, pri bakterijski pa je ukrivljena. Nihanje povezovalne vijačnice med ravnim in ukrivljenim stanjem premakne hibrid DNA-RNA za 3 Å oziroma za dolžino enega nukleotida. Ta mehanizem je v skladu s kasnejšimi biokemijskimi in genetskimi raziskavami.

Ločitev verige

Struktura po translokacijskem stanju kaže, kako pokrovu podobna zanka v polimerazi ločuje novonastalo verigo RNA od matrične DNA na mesto -8, kar povzroči popolno ločitev dveh verig na mestih -9 in -10. Zadnji nukleotid dodan RNA je na mestu -1. Skupaj z dvema drugima proteinskima zankama pokrov preprečuje ponovno združitev verig RNA in DNA.

Izbor nukleotida.

Nukleozidni trifosfati se gibljejo proti aktivnemu centru RNA-polimeraze skozi lijakasto odprtino v strukturi. Z namakanjem kristalov transkripcijskega kompleksa po translokacijskem stanju z ribonukleozidnimi trifosfati, ki se ne ujemajo z DNA-bazo na mesto +1 in ne ujemajočimi nukleotidi je bilo mogoče preučiti kako encim izbere nukleotide v aktivnem mestu encima. Selekcija poteka preko dvostopenjskega mehanizma, kjer se nukleotid prvotno vezan v obrnjeni orientaciji na vstopnem mestu pod aktivnim mestom. Ta vezava močno poveča življenjsko dobo nukleotida v področju aktivnega mesta. Vezavi na vstopno mesto sledi rotacija nukleotida v aktivno mesto, kjer se selektivno veže z matrično DNA. Če se vstopna in matrična baza ujemata, se tvori fosfodiesterska vez s kovinskim ionskim katalizatorjem. Tako namreč poteka pri vseh polimerazah nukleinskih kislin. Natančnost pri transkripciji je določena z baznimi pari in lastnostmi hibrida RNA-DNA. Na protein vezana hibridna vijačnica predstavlja nestandardno potrditev intermediata med A- in B- konformacijo DNA. Ta oblika je manj zvita v primerjavi s prostim hibridom DNA-RNA. Vključevanje napačne baze bi vodilo k destabilizaciji hibridne vijačnice zato poteka izbira selektivno.

Prepoznavanje promotorja, neuspela iniciacija, odstranitev promotorja.

Struktura RNA-polimeraze II ni pomembna samo za razumevanje transkripcijskega mehanizma. Omogoča tudi razširitev strukturnih analiz na večjem funkcionalne komplekse s splošnimi transkripcijskimi faktorji in mediatorjem, kar je ključ za razumevanje transkripcijskega procesa pri evkariontih. Kornberg je že naredil prvi korak v tej smeri z odkritjem strukture kompleksa splošnega transkripcijskega faktorja TFIIB in RNA-polimeraze II. Pod posebnimi pogoji TFIIB in TBP lahko tvorita začetni kompleks z RNA-polimerazo in DNA. Kristalna struktura prikazuje mehanizem začetka transkripcije. Samo eno področje (alfa vijačnica C-terminalne domene) TFIIB so bilo razrešili v ko-kristalu, vendar je to omogočilo, da so pri strukturi  upoštevali prej odkrito strukturo kompleksa TFIIB-TBP-DNK. TBP ukrivi področje zaporedja TATA in s tem usmeri spodnji del DNA proti aktivnem mestu. Ukrivitev omogoči prileganje DNA obliki polimeraze z razmikom okoli 25 nukleotidov med zaporedjem TATA in začetnim mestom transkripcije. Takšen razmik je značilen za večino promotorjev RNA polimeraz II. Prej opažen pojav neuspelega začetka in zdrs s promotorja so tako lahko razložili. Neuspel začetek je napaka mnogih transkriptov, da bi zarasli čez 10 ostankov in zdrsa promotorja je odstranitev prepisujoče RNA-polimeraze s promotorja po sintezi več kot 10 ostankov RNA. Zanka se tvori iz N-terminalnega dela TFIIB v aktivno mesto polimeraze, kjer se konča z novonastalim hibridom DNA-RNA. Če vpliv zanke prevlada, se RNA veriga zamakne, kar povzroči prekinitev reakcije, če pa vpliv RNA verige prevlada, se zamakne zanka, skupaj z TFIIB in promotorjem na DNA, kar omogoča RNA-polimerazi, da uide s promotorja in se začne verige RNA podaljševati.

Transkripcijski iniciacijski kompleks.

Z združitvijo rezultatov rentgenske strukturne analize in elektronske mikroskopije je Kornberg s kolegi prav tako predstavil model iniciacijskega kompleksa transkripcije skupaj s petimi splošnimi transkripcijskimi faktorji. Pomembno je odkritje, da se pet splošnih transkripcijskih faktorjev veže direktno na dvojno vijačnico DNA promotorja, medtem ko se RNA-polimeraza lahko veže na DNA samo po tem ko se spoji z vijačnico. Taka povezava povzroča ukrivitev matrične DNA za 90°, kar omogoči da matrična veriga lahko vstopi v reži aktivnega mesta v reži polimeraze.

Elektronska mikroskopija RNA-polimeraze II s kompleksom mediatorja kaže mediator kot polkrožno stukturo okoli polimeraze. Mediator sestavlja okoli 20 polipeptidov s skupno maso 1 MDa, kar otežuje raziskave. Nedavno so preučili izražanje ter izolirali funckionalni del mediatorja. Ta kompleks sestavlja samo sedem podenot z maso okoli 223 kDa. Interakcija med mediatorjevim funkcionalnim delom in RNA-polimerazo zahteva prisotnost splošnega transkripcijskega faktorja TFIIF. Celovito molekularno poznavanje vloge mediatorja bo zahtevalo še veliko dela na področju kristalografije polimeraz.

Zaključek

Kot rezultat mehanističnega raziskovanja evkariontske transkripcije je Roger Kornberg razvozlal molekularni mehanizem hibrida DNA-RNA in njegovega prepisa po dodatku nukleotida. Vemo tudi, kako je na novo sintetizirana veriga RNA ločena od DNA-matrice ter ob pravilni selekciji ribonukleotidov, ki so komplementarni DNA matrici.

Poleg tega je struktura RNA-polimeraze II osnova za nove raziskave, za določitev preciznih operacij z osnovnimi transkripcijskimi faktorji ter mediatorjem in za razjasnitev transkripcijske regulacije.

Kornberg je že objavil strukturo ko-kristala med RNA in polimerazo in TFIIB z rentgensko strukturno analizo. Objavil je tudi elektronsko-mikroskopsko strukturo med polimerazo, drugimi transkripcijskimi faktorji in mediatorjem. Visoko ločljiva strukturna analiza popolnih funkcionalnih transkripcijskih procesov bo dokončno razkrila molekularni mehanizem transkripcijske regulacije.

To znanje je pomembno pri motnjah transkripcijske regulacije, kar je povezano tudi z rakastimi obolenji, alergijami, boleznimi srca in ožilja ter z metaboličnimi motnjami. Regulacija prepisa kontrolira tudi razvoj izvornih celic v specifične celice z določenimi funkcijami v točno določenih tkivih. Tako lahko izkoristimo potencial, ki nam ga ponujajo izvorne celice, da z njimi zdravimo bolezni. Zelo pomembno je, da smo zmožni ustvariti le želene tipe celic.

Viri in literatura:

Naslovna slika: http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Nobel_medal_dsc06171.jpg (6.3.2007)

http://en.wikipedia.org/wiki/Roger_D._Kornberg (6.3.2007)
http://mednews.stanford.edu/kornberg/ (7.3.2007)
http://en.wikipedia.org/wiki/Nobel_Prize (9.3.2007)
http://www.gm.com/company/gmability/philanthropy/cancer_research/Alfreadsloan2005.htm (5.3.2007)
http://sl.wikipedia.org/wiki/Nobelova_nagrada (9.3.2007)
http://bmb.pharma.hr/predavanja/rna/sld023.htm (6.3.2007)
http://www.genetika.si/slike/vsebina/File/Rastlinska%20B/predavanje%2006-07/Transkripcija%20in%20procesiranje.pdf?PHPSESSID=6978e45956fdbd74e62070cc97adb396 (6.3.2007)