Pesticidi ali fitofarmacevtska sredstva,  Organofosfatni pesticidi, Namen,  Splošni del, Pesticidi, Delitev pesticidov,   Razširjenost pesticidov, Delovanje pesticidov na organizme,  Organofosfatni pesticidi,  Zgodovinski prEgled,  Delitev op pesticidov,  Kemijske pretvorbe organofosfornih spojin,  Hidroliza,  Oksidacija,  Delovanje, Voda, Zemlja, ... skratka vse kar ste kdaj hoteli vedeti o pesticidih  na enem mestu. Slovenski kemisjki portal se zahvaljuje avtorjema za poslano gradivo.

PESTICIDI – UPORABNE ALI NEVARNE SPOJINE? MERITEV OP PESTICIDA V SADOVNJAK

Kazalo

Povzetek

Abstract

1 Uvod

1.1 Pesticidi ali fitofarmacevtska sredstva

1.2 Organofosfatni pesticidi

Namen

2 Splošni del

2.1 Pesticidi

2.1.1 Delitev pesticidov

2.1.2 Razširjenost pesticidov

2.1.3 Delovanje pesticidov na organizme

2.2 Organofosfatni pesticidi

2.2.1 Zgodovinski prEgled razvoja organofos-fatnih pesticidov

2.2.2 Delitev op pesticidov

2.2.3 Kemijske pretvorbe organofosfornih spojin

2.2.3.1 Hidroliza

2.2.3.2 Oksidacija

2.2.4 Delovanje organofosfatnih pesticidov

2.2.4.1 Delovanje diazinona na organizme

2.2.5 Organofosfatni pesticidi v okolju

2.2.5.1 Voda

2.2.5.2 Zemlja

2.2.5.3 Živila

2.2.6 Kvalitativno in kvantitativno določanje pesticidov

3 Eksperimentalni del

3.1 Osebna izkaznica Diazinona

3.2 Reagenti, raztopine in instrument

3.3 Umeritvena krivulja za diazinon v zemlji

3.4 poskus v naravi

3.4.1 Škropljenje z diazinonom v SC Bilje 2002

3.4.2 Vzorčenje

3.4.3 Priprava vzorcev

3.4.4 Analiza

4 Zaključek in razprava

5 Viri in literatura

Povzetek

Pesticidi so eni od mnogih faktorjev, ki dandanes ogrožajo življenje nas in našega okolja. Kratkoročno gledano so zelo uporabni v kmetijstvu kot sredstva za uničavanje škodljivcev (plevelov in raznih žuželk). Zanimalo nas je koliko so ti strupi razširjeni in kako vplivajo na organizme, predvsem na človeka. Spoznali smo, da marsikdo po nepotrebnem uporablja te vrste zaščito in to v večjih količinah kot je predpisano. Po drugi strani pa bi bilo brez pomoči pesticidov občutno manj pridelka. Ko pa se seznanimo s poškodbami kromosomov, mutacijami, rakovimi tvorbami in drugimi pojavi, ki so jih povzročili, se vprašamo ali je bilo vredno začeti z njihovo namerno uporabo. Osredotočili smo se na organofosfatne pesticide, natančneje na insekticid diazinon. Analizirali smo zemljo iz sadovnjaka v Sadjarskem centru Bilje in ugotovili, da je bila količina diazinona nižja od 0,1 mg/kg, kar je bila meja naše detekcije, torej zanemarljiva.

Abstract

Pesticides are only one of major factors that threaten our daily life and our environment. They are mostly used in agriculture as pest agents (weeds, insects), so we were interested in the toxicological effects expresed in exposed human beings. Unfortunately, we have recognised, that they are used unnecessarily in huge amounts. But we are also awared that the crop production could not decrease. The big question, however still remains: why have we started using pesticides according to their adverse effects presented in living organisms (chromosomes damage, mutations, cancerogenity,...)? Our work was based on the study of organophosphate pesticide - diazinon used in the orchard in Bilje. The concetration of diazinon did not exceede the limit of detection which was 0,1 mg/kg.

1 Uvod

1.1 Pesticidi ali fitofarmacevtska sredstva

V intenzivnem kmetijstvu uporabljajo pesticide - fitofarmacevtska sredstva za zaščito rastlin pred boleznimi in škodljivci. Poznamo več vrst pesticidov in glede na njihovo funkcijo ločimo: zaščito pred pleveli (herbicidi), žuželkami (insekticidi), glivami (fungicidi), idr. Pesticidi, pa žal ne vplivajo zgolj na kvantiteto pridelane zelenjave, temveč tudi na njeno kvaliteto in vnos pesticidov v človeško prehrano. Toksičnost pesticidov pa je odvisna od kemijske sestave, metabolizma v človeškem telesu, koncentracije, načina uporabe, stopnje razgradljivosti, načinov prehajanja v organizme, mutagenosti,... [1]

Tisto, kar imenujemo pesticid, je aktivna substanca, ki je v manjši koncentraciji primešana inertnemu mediju. Tako imenovana inertna komponenta je nosilec oz. stabilizator aktivne substance in naj bi bila pomembna tudi pri nanašanju pesticida. Obe skupaj predstavljata pripravek, ki ga navadno prodajajo pod nekim komercialnim imenom.

Z uveljavitvijo neizprosne logike tržne ekonomije v kmetijstvu, ki zahteva vedno več pridelane hrane na enoto površine, je bil kmet pahnjen v t.i. kemizacijo. Na tržišču prodajajo fitofarmacevtske izdelke, kot običajne potrošniške artikle (reklame, oglasi,...), ki jih lahko kdorkoli kupi in uporablja. Poleg tega je glavna težava pri tretiranju zemljišč in različnih kultur v poljedelstvu v nespoštovanju predpisanih koncentracij. Po pogovoru s pridelovalci Vipavske doline, lahko trdimo, da velika večina predpisani natehti fitofarmacevtskega sredstva doda po svoji presoji vsaj še polkratno ali celo dvakratno zatehto. Poleg tega pa veliko pridelovalcev sega po pripravkih, ki niso registrirani v Sloveniji, so pa v prosti prodaji v sosednji Italiji.

Vprašanje ostankov pesticidov v hrani je verjetno eden najtežavnejših in najbolj žgočih problemov. Fitofarmacevtska industrija razvija sredstva za zatiranje škodljivcev in jih spremlja do njihovega razpada, nato zaščitnemu sredstvu predpiše karenco (to je čas od škropljenja do uporabe) ter sredstvo odda na trg. Žal njihovih razpadnih produktov, ki so za okolje lahko bolj škodljivi kot pesticidi sami, ne spremlja. Živilska industrija pa vseeno ob vsaki priložnosti prepričljivo zatrjuje, da teh ostankov sploh ni. Če pa že nekaj malega ostane v hrani, je to za porabnika popolnoma neškodljivo. Neka snov, ki jo danes vsiljujejo v javno uporabo kot popolnoma neškodljivo, kot pravi čudež današnjega dne, pa se lahko že jutri pokaže kot izjemno nevarna.

Pesticidi, ki jih posipamo po poljih, sadovnjakih, vrtovih in gozdovih, ostanejo dolgo časa v zemlji, kemično se lahko tudi spremenijo in ubirajo pota, ki jim sodobna kemija ne more slediti. Iz zemlje jih vsrkavajo rastlinske korenine, lahko pa prodrejo tako v telesa mikroorganizmov, kot tudi v večje živali, npr.: v deževnike. Preko prehranjevalnih verig tako prehajajo iz organizma v organizem, in končno tudi do človeka, lahko pa jih človek tudi neposredno zaužije s sadjem in zelenjavo. Del ostankov se tudi izpira v podtalnice in nato pride z izviri vode spet v naravni krogotok. Vse to zastrupljanje pa samo zato, da bi ubili nekaj vrst nadležnih žuželk in uničili nekaj plevelov [2].

1.2 Organofosfatni pesticidi

Kot produkt vojne se je pojavil tudi eden najbolj toksičnih organoklornih insekticidov, DDT, čigar proizvodnja je bila cenena, učinek pa strahoten. Uspešnost te zvezde je botrovala k temu, da so po vsem svetu farmacevtske družbe začele intenzivno vlagati v razvoj novih in novih sintetičnih pesticidov. Ob koncu 60-ih let se je začelo obdobje uporabe neznanskega števila novih pesticidov, ki so povzročili veliko škode okolju in ga v nekaterih primerih tudi trajno spremenili. Rachel Carson je s knjigo »Silent Spring« opozorila na simptome umirajočega okolja in tako spodbudila močan framacevtski lobi k prehodu na manj toksične spojine, kmetijski pa na manjšo uporabo pesticidov. V tem obdobju so persistentne organoklorne insekticide zamenjali organofosfatni insekticidi, ki so manj časa obstojni in so se razvili iz kemičnega orožja - bojnih plinov (tabun, sarin,...).

Organofosfatni (OP) pesticidi temeljijo na inhibiciji encima acetilholinesteraze (AChE), encima, ki je odgovoren za prenos živčnih impulzov v žuželkah, ostalih višje razvitih živalih in človeku. Posledica učinkovanja OP pesticidov je zmanjšano delovanja AChE  ter pogin škodljivcev .

Diazinon je OP pesticid, ki se uporablja kot zaščita rastlin pred listnimi ušmi in ostalimi škodljivci. V Sloveniji je diazinon registriran in komercialno dosegljiv pripravek znan pod različnimi imeni: Basudin 600 EW (aktivna snov: 60% diazinon), Basudin 40 WP, Diazol, Diazinon 20,... [3]

Namen

Uporaba pesticidov v intenzivnem kmetijstvu narekuje spremljanje prisotnosti teh spojin v okolju, njihovo morebitno adsorpcijo v tleh in razgradnjo ter nastanek metabolitov. Glede na to, da smo merili prisotnost diazinona v zemlji iz sadovnjaka, smo našo nalogo usmerili predvsem v študij OP pesticidov.

Namen naše raziskovalne naloge je torej bil:

• ugotoviti razširjenost uporabe pesticidov;

• spoznati nevarnosti, ki jih le-ti pozročajo;

• določiti količino diazinona v zemlji iz sadjarskega centra v Biljah.

2 Splošni del

2.1 Pesticidi

2.1.1 delitev pesticidov

Pesticide lahko razdelimo na skupine glede na njihovo kemijsko sestavo (tabela 1), glede na ciljno skupino organizmov, ki jih uničujejo (tabela 2), ali glede na vpliv na zdravje človeka [2].

Tabela 1: Razdelitev pesticidov glede na njihovo kemijsko sestavo:

Tabela 2: Razdelitev pesticidov glede na ciljno skupino, ki jo uničujejo

2.1.2 Razširjenost pesticidov

Pesticide srečamo že v antiki, bolj pa se razširijo nekje v srednjem veku, in so posledica vedno večjih potreb po hrani med hitro rastočim prebivalstvom. Hrano so sprva pridobivali na povsem naraven način, brez umetnih gnojil in zaščitnih sredstev. Vendar se je  število prebivalcev povečalo do take mere, da pridelava po naravni poti ni zadoščala. Začela so se pojavljati umetna gnojila in zaščitna sredstva. Ugotovili so namreč, da se da z nekaterimi snovmi zaščiti kulture pred škodljivci, tako so izboljšali kakovost pridelka in preprečili njegovo izgubo. Na območju z razvitim kmetijstvom (Severna Amerika, Evropa in Japonska) je izguba pridelka med 10 in 30 %.  Medtem ko so izgube v krajih, kjer je kmetijstvo manj razvito, tja do 75 %. Največ škode še vedno povzročajo roji kobilic.

Tabela 3: Poraba pesticidov po območjih

Intenziteta uporabe pesticidov v svetu je odvisna predvsem od: vrste pridelka (monokulture so bolj izpostavljene), stopnje razvitosti dežele (manj razvite so bolj nagnjene k pretirani porabi), podnebnih razmer, pojavnosti škodljivcev.

WHO (World Health Organization) opozarja na velike težave pri pridobivanju ustreznih podatkov o vrstah in količinah prodanih pesticidov v svetu. Zadnje podatke je leta 1977 zbral Green in po njih se je prodaja pesticidov od leta 1945 do leta 1975 nenehno povečevala. Po Greenovih podatkih se je količina prodanih pesticidov v svetu do leta 1985 gibala nekako takole:

Graf 1: Svetovna poraba pesticidov do leta 1985.

Globalna poraba pesticidov v svetu naj bi bila leta 1985 približno 3 milijone ton. Poglejmo si razporeditev njihove porabe po skupinah pesticidov na posameznih območjih sveta. Tabela 4 prikazuje vrednost trga pesticidov v milijonih dolarjev za leto 1985.

Prodajna vrednost pesticidov je leta 1985 dosegla približno 16 milijard dolarjev. Od tega so jih približno 20 odstotkov produkcije oziroma 600000 ton prodali v države v razvoju.

Tabela 5: Odstotek prodaje po območjih

Tabela 6: Odstotek prodaje po državah v razvoju

Graf 2: Globalna struktura porabe pesticidov v letu 1985

Iz grafa 2 lahko razberemo, da večino herbicidov porabijo na poljih koruze in soje. Insekticide uporabljajo največ pri pridelavi bombaža, največje količine fungicidov pa pri pridelavi pšenice in zelenjave. Podatki seveda veljajo za svet v celoti, krajevno pa se lahko občutno razlikujejo. Takšni so torej podatki v publikaciji WHO. V različnih literaturah dobimo različne podatke [2]. 

Po temeljitem pregledu internetnih strani smo ugotovili, da se poraba pesticidov v posameznih državah v zadnjih desetih letih večinoma zmanjšuje. Podatkov o celokupni porabi pesticidov v svetu žal nismo zasledili niti na spletnih staneh mednarodnih agencij WHO, EPA, itd. Primer porabe pesticidov v evropskih državah je prikazan na spletni strani evropske okoljske agencije (EEA - European Environment Agency) [4].

Tabela 7: Indeks povečane prodaje pesticidov med leti 1980 - 1984.

Proizvajalke pesticidov, multinacionalke s področja kemije in farmacije imajo na domačih trgih težave zaradi prepovedi prodaje in uporabe najnevarnejših pesticidov. Te prepovedi pa ne veljajo za njihov izvoz na tuje trge. Zanimivo je, da gredo najbolje v promet prav najbolj toksične snovi.

2.1.3 Delovanje pesticidov na organizme

Pesticidi so le del nevarnosti, ki danes prežijo na nas. Preplavljajo cel svet in nas zastrupljajo neposredno ali posredno, zato jih niso zaman poimenovali biocidi, ubijalci življenja.

Iz umetnega človekovega agroekosistema se prenašajo in razširjajo po celotnem planetu. V naših telesih nakopičeni pesticidi s svojim biocidnim delovanjem motijo temeljne življenjske procese v celicah in tkivih. Pri tem ne moremo govoriti o dopustni količini toksina, saj že nekaj molekul sproži v celici plaz hudih poškodb.

Skrbeti bi nas morale predvsem dolgoročne posledice delovanja teh toksinov. Te se lahko pokažejo nenadoma, brez predhodnih znamenj. Akutne zastrupitve prebivalstva s pesticidi so že same po sebi dovolj tragične in nas dovolj jasno opozarjajo, da imamo opravka z izjemno nevarnimi snovmi.

Zelo opazni so učinki pesticidov na reprodukcijo organizmov (Tabela 7):

Tabela 8: Učinki pesticidov na vitalne procese

Poškodbe človeških kromosomov in z njimi povezane mutacije genov se v generacijah hitro kopičijo. Nastajajo povsem po naključju. Že le en sam napačno vgrajen nukleotidni par je lahko usoden za nadaljni obstoj celice. Poleg teh naključni napak, pa še pesticidi  s svojim mutagenim delovanjem in genotoksičnimi učinki delujejo prav genski zapis. Tako se možnost napak močno poveča.

Pesticidi vstopajo v naša telesa skozi tri poglavitne vhode:

• skozi usta; z užitno hrano in pijačo;

• skozi pljuča; ko določene količine teh strupov vdihnemo;

• skozi kožo; ko se absorbirajo skoznjo.

Osnovne fiziološke efekte razdelimo (F. Ramade, 1987) na naslednje skupine:

• poškodbe telesnih celic;

• nevrotoksičnost, vse poškodbe nevronov (živčnih celic) so nepovratne, ireverzibilne;

• poškodbe hormonskega ravnovesja;

• poškodbe organov izločanja; predvsem jeter in ledvic, za zaščito citrusov, na primer, med transportom zelo pogosto uporabljajo fungicid difenil. Dolgotrajna izpostavljenost temu toksinu povzroča razpad ledvičnih čašic in zbirnih kanalov ledvic;

• motnje delovanja imunskega sistema;

• poškodbe respiratorne funkcije; pojavljajo se direktno na pljučih (posledica akutnih zastrupitev s pesticidi) ali pa na celičnem nivoju (zaradi dolgoročnih posledic so bolj zahrbtne);

• poškodbe zarodnih celic;

• zmanjšanje sposobnosti razmnoževanja (biotičnega potenciala); najbolj opazna je pri pojavu sterilizacije spolno zrelih osebkov;

• mutageno delovanje; posledice delovanja pesticidov popolnoma enake posledicam radioaktivnega sevanja. Nastale zigote namreč ne formirajo normalnega embria;

• teratološki efekti; poleg klasičnih oblik in iznakaženosti zarodkov povzročajo pesticidi tudi poznejšo sterilnost zrelih osebkov.

Patofiziološke probleme, ki so posledica delovanja pesticidov na organizem človeka delimo na: alergije, mutagenezo, kancerogenezo in teratogenezo.

• alergije so predvsem astme;

• mutageneza se pojavlja kot prva stopnja kancerogeneze na somatičnem nivoju in kot pojav irreverzibilnih mutacij pri celicah zarodka. Posledice so iznakaženi zarodki, splavi in dedne bolezni;

• kancerogenezo povzročajo poškodbe DNA. Pesticidi delujejo na genski material v dveh poglavitnih točkah:

• na genski program, katerega fizična realizacija se izkaže šele v potomcih.

• na PRP (tisti del genoma, ki uravnava življenjske funkcije in metabolizem osebka)

Praviloma bi morala znanost pred začetkom komercialne uporabe vsakega pesticida poznati njegove posledice za človekovo zdravje pri določenih dozah, kot tudi razmerje med količino pesticida in reakcijo organizma. Za večino pesticidov ti podatki niso znani, zato preventivo opravljajo z določanjem LD 50. To je tista količina pesticida, pri kateri pogine 50 odstotkov poskusnih živali. Navadno pri takih poskusih uporabljajo miši, zato se večina podatkov nanaša nanje.

V naravnem okolju hkrati deluje na organizme več deset različnih toksinov in njihovih metabolitov, zato so njihovi skupni vplivi (sinergizem) nanje vsekakor lahko občutno drugačni, kot so efekti posamezne substance. Sinergistično delovanje dveh ali več substanc je lahko celo smrtno nevarno, čeprav vsaka posebej sicer ne deluje toksično [2].

2.2 Organofosfatni pesticidi

2.2.1 Zgodovinski prEgled razvoja organofos-fatnih pesticidov

Organofosfatni estri (v nadaljevanju OP) so široka skupina organskih spojin, ki jih v intenzivnem kmetijstvu uporabljajo za kontrolo škodljivcev na rastlinah in živalih. OP uporabljajo najpogosteje za zatiranje žuželk (insekticidi), pršic (akaricidi) in ogorčic (nematicidi), lahko pa služijo tudi za zatiranje plevela (herbicidi) in povzročiteljev glivičnih bolezni (fungicidi). Toksičnost OP se kaže v inhibiciji encima acetilholinesteraze (AChE), encima, ki je odgovoren za prenos živčnih impulzov.

Začetki poznavanja OP segajo v leto 1820, ko je Lassaigne iz etanola in fosforne kisline sintetiziral trietil fosfat. 80 let kasneje je Gerhard Schrader ugotovil pri tej spojini, danes znani kot TEPP, insekticidne lastnosti. Naslednji prevoj v razvoju OP, je bilo odkritje tiofosfornih estrov (Cleoz, l. 1847), sledila je pretvorba trialkil fosfitov v dialkil fosfonate (Michaelis in Becker, l. 1879) in sinteza fosforamid dikloridatov iz triklorofosfida (Michaelis, 1903) [5].

Kljub temu, da je Schrader l.1937 odkril dva živčna plina, tabun in sarin, je bil prvotni namen njegovih raziskav razvoj insekticidov. Nadaljne raziskave so vodile k odkritju dimefoksa, oktametilpiroforforoamida (OMPA) in parationa. Paration danes obravnavamo kot modelno OP spojino [5].

Odkritja so narekovala verižno sintetiziranje podobnih OP spojin, katerih skupna lastnost je bila žal akutna toksičnost tudi za sesalce. Sinteza prvega manj škodljivega OP, malationa, je pomenila preobrat med aktivnimi insekticidi in manj škodljivimi pripravki za ljudi. Razvoj, za človeka manj nevarnih OP, je pomenil napredek v fitofarmacevtski industriji in umik, do tedaj široko uporabljenih organoklornih pesticidov. Po letu 1970 uporabljajo večinoma OP za zatiranje škodljivcev.

2.2.2 DELITEV OP PESTICIDOV

Nomenklatura organofosfatnih spojin je v večini primerov zelo zapletena, zato uporabljamo pri poimenovanju določeno sistematiko. Spojine poimenujemo po najbolj reaktivnem substituentu (ki je hkrati tudi izstopajoča skupina): anhidridni, alifatski, aromatski, heterocikličen,... Okrog centralnega fosfornega atoma so prostorsko razporejene tri enojne vezi in ena dvojna. Kemijsko so te spojine derivati fosforne kisline. Fosfor je vezan z dvojno vezjo ali na kisikov atom ali žveplo, ostale estrske vezi pa so lahko med žveplom, kisikom, dušikom in ogljikom.

Pravi fosfati, ko je fosfor obkrožen s štirimi kisikovimi atomi, so zelo reaktivni. Uporabljamo jih predvsem tedaj, ko želimo intenzivno aktivnost s kratkotrajnim učinkom.

Slika 1: Diazinon, predstavnik fosforotionatov

Tretja skupina so fosforotionotiolati, kjer sta dva žveplova in dva kisikova atoma vezani na fosforjev atom, od tega je en  žveplov atom vezan z dvojno vezjo. Izstopajoča skupina pri takem fosfatnem estru je ponavadi tioestrska skupina. Ta skupina vključuje zelo strupene spojine.

2.2.3 Kemijske pretvorbe organofosfornih spojin

OP spojine se lahko pretvorijo na več načinov, vendar so poglavitne tiste reakcije, ki so vezane, na cepitev vezi na fosforjevem atomu. Poglavitni procesi kemične preobrazbe (transformacije) potekajo na treh ravneh, kot:

• fotorazgradnja;

• kemična razgradnja;

• biološka razgradnja, pri kateri imajo poglavitno vlogo mikrobi. Zato jo nekateri avtorji poimenujejo kar mikrobiološka razgradnja.

Razgradnja poteka predvsem v prsti, usmerjajo jih lastnosti prsti kot so pH, vsebnost glin in vsebnost organske komponente v prsti. Pomembnejši dejavniki so lahko še lastnosti pesticida, klimatski faktorji in sestava prsti. V biokemičnih procesih igrata vodilno vlogo hidroliza in oksidacija.

 2.2.3.1 HIDROLIZA

Hidroliza je razpad estrov na kislinski in alkoholni del. Stopnja hidrolize je tako odvisna od kislinskega kot tudi od alkoholnega dela molekule, pH in temperature. Za večino OP poteče hidroliza kot cepitev vezi med fosforjem in izstopajočo skupino v bazičnih pogojih. Nekateri OP pa razpadejo raje v kislih pogojih. Tak primer je diazinon, slika 2. [5]

Hidroliza je tudi temperaturno kontroliran proces. Prav tako pa so ugotovili, da tako vodne raztopine pesticidov kot tudi pesticidi v sedimentih hitreje razpadejo pod vplivom svetlobe. [6]

Slika 2: Kislinsko katalizirana hidroliza diazinona do 2-izopropil-6-metil-4-pirimidinol - IMP in O,O-dietil fosforotioata

2.2.3.2 Oksidacija

Oksidacija je najpogostejša pri tio analogih (P=S, dvojna vez), ki se oksidirajo v okso analoge (P=O, dvojna vez). Ta proces se imenuje desulfurizacija in ga pospešuje osvetljevanje z UV svetlobo v prisotnosti kisika. Reakcija oksidacije diazinona je prikazana na sliki 3. Slaba stran tega procesa je v večji toksičnosti okso analogov v primerjavi s tio derivati. [5]

Slika 3: Oksidacija diazinona v diazookson

2.2.4 DELOVANJE ORGANOFOSFATNIH PESTICIDOV

OP spojine reagirajo z veliko večino proteinov, vključno z encimi. Njihova insekticidna učinkovitost se kaže v inhibiciji acetilholinesteraze. Dokazano je, da pri reakcijah in vitro vplivajo na holinergične receptorje.

Inhibicija AChE z OP spojinami je ireverzibilen proces. Ireverzibilnost se kaže v tem, da se po ponovni aktivaciji encima OP spojina kot substrat transformira. Inhibicija encima pa ni ireverzibilen proces. [5]

V acetilholinu, normalnem substratu AChE, se na serinskem mestu hidroksilna skupina v aktivnem mestu encima acetilira in nato sprosti holinsko vez. Kompleks acetil-AChE pa se nato zopet hidrolizira v 0,15 milisekundi, kar omogoči nadaljni prenos živčnih impulzov. OP reagira povsem enako, torej tekmuje z acetilholinom za aktivno mesto encima. Pri vezavi OP na AChE, pa encim izgubi katalitske aktivnost. Razpolovni čas hidrolize takega kompleksa pa je 60 ur.

2.2.4.1 Delovanje diazinona na organizme

Diazinon spada med ireverzibilne inhibitorje acetilholinesteraze, kamor spadajo vsi organofosfati. Kot posledica inhibicije acetilholinesteraze se pri akutnih zastrupitvah z organofosfati čezmerno kopiči nepresnovljen acetilholin v centralnem in perifernem živčnem sistemu, krvi in drugih organih. Odvisno od teže zastrupitve nastaja stimulacija ali paraliza prenosa živčnih impulzov v centralnem živčnem sistemu, vegetativnih ganglijih, skeletnih in gladkih mišicah, eksokrinih žlezah in kardiocirkulacijskem sistemu. Simptomi in znaki: slabost, bruhanje, driska, znojenje... Znaki težke zastrupitve pa so izguba zavesti, fascikulacije mišic, prenehanje dihanja. Vsi bolniki, ki so zastrupljeni z inhibitorjem holinesteraze, so življenjsko ogroženi, ker je majhna razlika med toksičnim in letalnim odmerkom.

2.2.5 ORGANOFOSFATNI PESTICIDI V OKOLJU

2.2.5.1 VODA

Voda v okolju nam predstavlja vir pitne vode in življenjski prostor za vodne organizme. V intenzivnem kmetijstvu prihaja s spiranjem obdelovalnih površin do vnosa različnih organskih spojin v vodotoke. Koliko se bodo te spojine spirale  je odvisno predvsem od topnosti spojin v vodi. Pri tem je pomembna tudi sestava zemlje (humusna, peščena, glinena zemlja) in s tem njena prepustnost. Glede na  vedno večjo porabo pesticidov so določili mejo dopustnosti za vodne sisteme, ki znaša za posamezen pesticid 0,1 mg/l, medtem ko celokupna koncentracija vseh pesticidov ne sme preseči meje 0,5 mg/l.

Za OP pesticide nasplošno velja, da so v vodi slabo obstojni (do tri mesece). Izpostavljeni so hidrolizi, primer hidrolize diazinona prikazuje slika 2. Razpolovna doba je močno odvisna od pH, O₂, svetlobe in raztopljenih spojin, ki katalizirajo razpade (npr. huminske kisline). Večina OP razpada v bazičnih pogojih, zato je voda, ki teče po karbonatnih (apnenčastih) tleh manj izpostavljena vplivu pesticidov.

Nahajanje v naravni vodi je torej pogojeno s topnostjo pesticida v vodi in z izpiranjem zemlje. Diazinon je v vodi slabo topen (topnost = 40 mg/L), spada med relativno nepolarne OP spojine. Hidroliza diazinona poteka hitreje v kislih pogojih. IMP (razpadni produkt diazinona - 2-izopropil-6-metil-4-pirimidinol) je relativno polarna spojina, ki se v vodi dobro topi, njegov razpad v vodi pa poteka zelo počasi.

2.2.5.2 ZEMLJA

Obstojnost v zemlji je določena z ravnotežjem med adsorpcijo pesticidov na zemeljskih koloidih, z absorpcijo v rastlino, transformacijami ter razgradnjo in z izhlapevanjem, kar je shematsko prikazano na sliki 4. Ravnotežje je odvisno od tipa pesticida in zemlje, temperature, vlage ter osončenosti. [6]

Glede na akumulacijo pesticidov v zemlji, delimo pesticide na neobstojne (1-12 tednov), to so organofosfati, karbamati; delno obstojne (1-18 mesecev) to so triazini, fenoksiocetne kisline, obstojne (2-5 let), predstavniki so organoklorni pesticidi in trajne (se ne razgradijo) to so organokovinski kompleksi.

Razgradnja pesticidov v zemlji poteka preko kemijskih procesov in s pomočjo mikroorganizmov. Poznavanje kinetike in optimalnih pogojev razgradnje je bistvenega pomena za okoljevarstvenike in biologe. Razgradni produkti so navadno manj toksičnih kot izhodne substance, nekateri metaboliti, predvsem okso analogi tiofosfatov, pa so žal še bolj nevarni za ljudi.

Kemijska razgradnja pesticidov obsega hidrolizo, oksidacijo/redukcijo in fotorazgradnjo. Na katalitske sposobnosti zemlje vplivajo prisotnost organskih substanc (huminske kisline), mineralna osnova in prisotni kovinski oksidi. [6]

2.2.5.3 ŽIVILA

Najvišje koncentracije OP pesticidov v živilih najdemo pri sadju in zelenjavi, ki se jih s temi pripravki neposredno škropi. Ostanke OP spojin pa lahko najdemo še v mesnih izdelkih in mleku. V živalska tkiva prehajajo skozi kožo, saj se OP uporabljajo kot insekticidi tudi v veterini.

Prehod pesticidov na zelenjavo in sadje (v nadaljevanju v rastline) je na dveh ravneh. S škropljenjem zemlje pred presajanjem rastline in nato z neposrednim škropljenjem listov in plodov. Pri rastlinah torej pesticid prehaja v/na rastlino z absorbcijo iz zemlje in z adsorbcijo na listih in plodovih. Delež absorbcije iz zemlje je pojav, ki je do danes še povsem neraziskan, obstajajo pa najrazličnejša predvidevanja in sklepanja. Pri večletnem zaporednem škropljenju zemlje je namreč težko podati vrednost absorbiranih pesticidov v rastlino. Delež adsorpcije po škropljenju pa danes redno spremljajo.

Prednost škropljenja rastlin z OP pesticidi, je v hitrejši transformaciji in razgradnji v primerjavi z ostalimi pesticidi. OP v vodi hitro razpadejo, zato je količina padavin pri razgradnji na rastlinah ključnega pomena. Topnost posameznega OP pa vpliva na spiranje pesticida iz rastline. OP razpadejo tudi pod vplivom fotolize, zato je pomembna osončenost obdelovalnih površin. 

Vsi ti procesi vplivajo na koncentracijo OP na rastlinah. Bistven proces pri zmanjševanju količine pesticidov na rastlinah pa je rast rastlin samih. Ob škropljenju je ponavadi rastlina še majhna, ob obiranju pa preseže svojo maso tudi do 50 krat in s tem posredno 50 krat zmanjša začetno koncentracijo pesticida. Če upoštevamo še spiranje, koncentracija na rastlini res ne preseže MRL (MRL = maximum residue limit, maksimalna dovoljena mejna vrednost izražena v ppm: 1 ppm = 1 mg pesticida / 1 kg suhe teže živila). Dejanjska količina pesticidov v naravi pa se v tem času od škropljenja do obiranja bistveno ne spremeni. 

2.2.6 KVALITATIVNO IN KVANTITATIVNO DOLOČANJE PESTICIDOV

V veliko sodobnih laboratorijih se dnevno soočajo z določevanjem pesticidov v hrani, vodi in zemlji.

Kapilarna plinska kromatografija je najširše uporabljena tehnika v analizi pesticidov. Trenutno služi za spremljanje 300 pesticidov od približno 500 registiranih vključno z metaboliti [7]. Pesticide, ki jih določajo morajo biti hlapni.

Prednost plinske kromatografije je v sposobnosti ločitve več pesticidov hkrati, občutljivost in selektivnost pa sta odvisna od detektorja. Za določevanje organoklornih pesticidov danes pretežno uporabljajo detektor na zajetje elektronov (ECD), dušik fosforjev detektor (NPD) pa uporabljajo za določanje OP in karbamatnih pesticidov. Za nedvoumno potrditev spojin v kompleksnih vzorcih uporabljajo večinoma masni detektor (MS), ki pa je žal za mnoge laboratorije predrag.

Pred vbrizgavanjem vzorca pesticidov na kromatografsko kolono jih morajo najprej izolirati iz okoljskih vzorcev (vode, zemlje, živil) in jih prenesti v hlapno organsko fazo. Izolacija pesticidov sodi med pripravo vzorcev in se za posamezen okoljski vzorec (vode, zemlje, živil) močno razlikuje, predstavlja pa daljši časovni del analize vzorcev. Pri plinski kromatografiji izbiramo za ekstrakcijo pesticidov iz matriksa hlapno organsko topilo v odvisnosti od kolone in detektorja.

3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 Osebna izkaznica Diazinona [8]

3.2 REAGENTI, RAZTOPINE IN INSTRUMENT

Uporabili smo naslednje kemikalije in reagente:

• za pripravo umeritvene krivulje:

O,O - dietil - O - (2 - izopropil - 6 - metil pirimidin - 4 - il) fosforo- tioat (diazinon), 98,8% čistost, Riedel de Haën;

etil acetat, 99,5% čistost, Riedel de Haën;

deionizirana voda.

• za poskus v naravi:

basudin različnih izhodnih koncentracij

• za ekstrakcijo:

etil acetat, 99,5% čistost, Riedel de Haën;

Vzorce smo analizirali na plinskem kromatografu HP 6890 s plamensko ionizacijskim detektorjem. Uporabili smo nepolarno kolono SPB-1 (30 m, 0,53 mm, 3 mm) - s stacionarno fazo polidimetilsiloksan. Pogoji kromatografske ločitve so bili naslednji:

Dimenzije kolone: SPB-1 30m x 0,53mm, debelina filma 3mm

Stacionarna faza: polidimetilsiloksan

Način: konstantni tlak

Tlak: 5,24 psi

Začetni pretok:6,1 mL/min

Povprečna linearna hitrost: 47 cm/s

Temperaturni program

Injektorski del

Način vbrizgavanja: splitless

Volumen vbrizgavanja: 4 mL

Začetna temperatura: 250°C

Tlak: 5,24 psi

Tok izpihavanja injektorja: 44,4 mL/min

Začetek izpihavanja injektorja: 1,00 min

Nosilni plin: helij

Detektor: plamensko ionizacijski (FID)

Temperatura: 250°C

Pretok vodika: 60,0 mL/min

Pretok zraka: 350,0 mL/min

"Make up" plin, dušik: 35,0 mL/min

Nosilni plin: helij

3.3 Umeritvena krivulja za diazinon v zemlji

Kromatografska ločba spada med relativne tehnike, kar pomeni, da moramo preden analiziramo realne vzorce, analizirati standardne raztopine, za katere vemo natančno koncentracijo. Površina signala, ki nam ga izriše programska oprema plinskega kromatografa pa je premosorazmerna koncentracijam standardnih raztopin, ki smo jih vnesli v plinski kromatograf. Glede na pripravljeno umeritveno krivulja (slika 5) pa nato umerjamo naše realne vzorce.

Preden smo analizirali zemljo iz sadjarskega centra Bilje, smo torej morali posneti kromatografske signale za standardne raztopine diazinona v koncentracijskem območju od 0,1 ppm (mg diazinona /kg suhe zemlje) do 5ppm.

Tabela 9: Odvisnost površine kromatografskega vrha od koncentracije diazinona v zemlji

Slika 4: Umeritvena krivulja za določanje diazinona v zemlji

  Slika 5: Kromatogram ekstrakta diazinona iz zemlje

Meja zaznavnosti je bila 0,1 mg/kg, kar pomeni, da pod to koncentracijo ne moremo zagotoviti pravilnosti meritve.

3.4 poskus v naravi

3.4.1 Škropljenje z diazinonom v SC Bilje 2002

Breskov sadovnjak je izpostavljen najrazličnejšemu škropljenju tako z umetnimi gnojili, kot tudi z pesticidi. Proti listnim ušem uporabljajo trikrat v sezoni diazinon v obliki različnih pripravkov. Tako smo špekulativno izračunali maksimalno predvideno koncentracijo diazinona v zemlji, brez upoštevanja spiranja in ostalih izgub

12.3.2002 diazinon 9% vsebnost diazinona Þ  1,5 % Þ 15L / 1000L / ha

14.5.2002 diazinon 20% Þ 0,4% Þ 4kg / 1000L / ha

14.6.2002 diazinon 20% Þ 0,2% Þ 3kg / 1500L / ha

1 ha je čez celo leto prejel, če upoštevamo gostoto raztopin 1 kg/L in gostoto zemlje 1,5 kg / L:

9% * 15kg = 1350g diazinona ~ c _{D V ZEMLJI} = 1,8 ppm

20% * 4kg = 800g diazinona ~ c _{D V ZEMLJI} = 1,1 ppm

20% * 3kg = 600g diazinona ~ c _{D V ZEMLJI} = 0,8 ppm

       
         2750g  - toliko diazinona je v ha zemlje, če ga nič ne razpade ali spere

ρ _zemlje Þ ilovnata = 1,5 g/cm³

Površina = 1 ha = 10 000 m²

Globina vzorčenja = 5 cm

Koncentracija diazinona v zemlji  = m diazinona /m zemlje = 2750 g diazinona / 10 000 m²  = 0,275 g /m²

Masa zemlje :  V (1 m², 5 cm globine) = a*b*c = 100 cm * 100 cm * 5 cm = 50000 cm³

ρ _zemlje = 1,5 g / cm³

m = ρ _zemlje * V = 1,5 g / cm³ * 50000 cm³ = 75000g

Koncentacija diazinona (celokupna):

m diazinona (na m² ) / masa zemlje ( na m², 5 cm v globino) = 275 mg / 75000g = 0,003667 mg / g = 3,667 mg / kg

Če povzamemo zgornje izračune naj bi zemlja v sadovnjaku vsebovala maksimalno 3,7 ppm diazinona brez upoštevanja naravnih izgub.

3.4.2 Vzorčenje

V sadjarskem centru v Biljah smo približno vsakih sedem dni vzeli vzorce zemlje.

Tabela 10: Datumi vzorčenja 

S 50 cm sondo (palica za vzorčenje zemlje v obliki črke T, dolga 50 cm, na dolžini 30 cm votla) smo vzorčili 5 cm v globino in zbrali približno 0,5 kg zemlje. Vzorčenje je potekalo v urejenem zaporedju vzdolž 4 vrst in med 25 drevesi v vsaki vrsti. Nato smo zemljo shranili v najlonsko vrečko in jo  zamrznili pri -16 °C.

 3.4.3 Priprava vzorcev

Najprej smo zamrznjene vzorce vzeli iz vrečk ter jih dali na časopisni papir, da bi se čez noč odmrznili in da bi voda izhlapela za nadaljnjo analizo suhe zemlje. Za določevanje vlage smo zatehtali 5 g svežega vzorca in ga dali v sušilnik za 2 uri, pri temperaturi 120 °C, da je voda popolnoma izhlapela. Posušene vzorce smo stehtali in izračunali absolutno vlago vzorca. 

 Tabela 11: Absolutna vlaga posameznih vzorcev zemlje

Slika 7: Obdelava posušene zemlje  

  Slika 8: Analitska tehtnica

Sledila je trikratna ekstrakcija :

Vsaki paralelki smo dodali 25 ml etilacetata in 10 min stresali. Ko se je zemlja polegla smo etilacetat z raztopljeni snovmi iz zemlje odlili skozi filtrirni papir v čašo.

Postopek smo ponovili še z 2 krat po 10 ml etilacetata. Vse tri ekstrakte smo združili v čašo.

Slika 9: Ročna ekstrakcija

Slika 10: Rotavapor

Označene čaše smo nato prekrili s parafilmom in jih dali v hladilnik, da bi etilacetat čim manj hlapel. V organskem topilu pa tudi naši pesticidi in ostale organske spojine ne razpadajo.

Ekstrakte smo prelili v bučke z okroglim dnom in z vakuumsko destilacijo (rotavapor) odhlapeli etilacetat (slika 13). Temperatura vodne kopeli ni presegla 50°C. Na dnu bučke so ostale prej raztopljene snovi med njimi tudi diazinon.

Nato smo bučke sprali z  2 ml etilacetata. Tako so bili vzorci pripravljeni za analizo na plinskem kromatografu.

3.4.4 Analiza

4 μL etilacetatnega ekstrakta smo vbrizgali na kromatografsko kolono ter ločitev spojin dosegli po že prej opisanem postopku. V prilogi so zbrani kromatogrami ene paralelke vsakega vzorčenja.

4 ZAKLJUČEK IN RAZPRAVA

S tem ko pesticidi omogočajo več pridelka (ki ni nujno tudi boljši), pa s svojim mutagenim in toksičnim delovanjem vplivajo tudi na človeka in na ostale organizme. Posledice so kratkoročno vidne le pri akutnih zastrupitvah, pri ostalih pa se kot napake na kromosomih, torej genetske okvare prenašajo iz generacije v generacijo. Glede na te njihove stranske učinke, bi si lahko znanost zamislila drugačne načine uničevanja škodljivcev.

Z našim eksperimentom v sadjarskem centru v Biljah, smo ugotovili, da je koncentracija pesticida - diazinona v prsti kljub intenzivnemu kmetijstvu in uporabi pesticidov, še vedno znižja od naše meje zaznavnosti (0,1 mg/kg suhe zemlje). To je rezultat pravilne uporabe in ostalih naravnih dejavnikov, kot sta sončna svetloba in spiranje (priloga 1 - 6).  

Poraba pesticidov v svetu je naraščala do leta 1995, nato pa je začela  upadati. To je posledica širše osveščenosti, ki je sprožila postopno zmanjševanje in obvezno nadziranje porabe pesticidov. Vendar kljub temu nekateri še vedno pretirano uporabljajo tovrstna sredstva in na tržišču so še vedno nekateri pesticidi, ki so dokazano toksični za ljudi in okolje, a k sreči prepovedujejo uporabo takih strupov in jih umikajo iz tržišča. Večina ljudi, ki se zaveda razsežnosti pretirane uporabe pesticidov teži k čim manjši uporabi. Še vedno so alternativni načini zaščite rastlin žal zastopani v zelo majhni meri.

Alternativo, ki jo ponujamo je povsem naravna. Rastline namreč vsebujejo prave antibiotike. Zanimivo je, da jih v zdravih rastlinah ne najdemo. Njihova biosinteza se začne šele po poškodbi rastlinskih celic ali po napadu mikrobov. Iz biokemije bi človeštvo lahko dobilo odlična biološka sredstva za zatiranje škodljivcev. Bogastvo biokemičnih aktivnih snovi živega sveta, tako rastlinskega kot živalskega pa je tako rekoč še neraziskano. Rastlinske snovi, na primer razni glikozidi, alkaloidi, eterična olja in še vrsta drugih kemičnih spojin, učinkovito odganjajo rastlinojede. Torej nam te spojine, ki jih v svoji strukturi sintetizirajo živi organizmi, predstavljajo rešitve za tovrstne današnje in prihodnje probleme človeštva [2]. 

5 Viri in literatura

1.       Ljubiša Grlić, Mali kemijski leksikon Napried, Zagreb, 1988.

2.     Anton Komat, Pesticidi, ubijalci življenja, Založba Tangram, Ljubljana, 1995.

3.     Mojca Bavcon, Razgradnja diazinona in malationa v okolju, Diplomsko delo, Ljubljana, 2001.

4.     http://dataservice.eea.eu.int/dataservice/viewdata/viewpvt.asp?id=

5.     Janice E. Chambers, Patricia E. Levi, Organophosphates, Chemistry, Fate, and Effects, Academic Press, 1992.

6.     Sheila Ross, Soil processes, Routledge, London, 1989.

7.     G. Rene van der Hoff, Piet van Zoonen, Trace analysis of pesticides by gas chromatography, J. Chromatogr. A, 843 (1999) 301-322.

8.     Priročnik o toksikoloških lastnostih pesticidov v Republiki Sloveniji,  Ternifi et al., Ministrstvo za zdravstvo, Ljubljana, 1998.

Avtorja: Tina Lozar in Kostja Makarovič